推荐意见1-1：推荐使用EDTA或枸橼酸抗凝的新鲜骨髓标本。
推荐说明：推荐使用EDTA或枸橼酸抗凝管采集新鲜骨髓样本，禁用肝素抗凝管以防止后续抑制PCR扩增。在患者初诊时期，推荐骨髓样本有核细胞总数≥3×104（一般样本量≥0.5 mL）；当骨髓样本无法获取时，可使用骨髓涂片，推荐涂片数量≥10张、厚度≥3μm、面积≥2cm2。对于随访样本，推荐骨髓有核细胞总数≥3×106（一般样本量≥2mL），以便灵敏度达到1/106 。如果患者无法获取骨髓，可考虑采用外周血替代，但是需要增加外周血样本量。新鲜骨髓和外周血推荐2-8℃保存3天内处理。新鲜骨髓不建议直接冻存-20℃或-80℃，避免对细胞活性影响造成结果偏差，但可采用单核细胞富集冷冻的形式长期保存。
推荐意见2-1： DNA提取需把控DNA纯度和完整性，建议OD₂₆₀/₂₈₀为1.8~2.0。
推荐说明：通用型全基因组提取试剂盒足够满足检测需求，提取的DNA在4 °C可以实现月内短期保存，‑20 °C甚至-80°C可实现数年长期保存。DNA浓度与纯度是样本核心质控指标，浓度需满足后续建库所需投入量，纯度推荐OD₂₆₀/₂₈₀比值在1.8~2.0之间。推荐实验室开展DNA完整性检测，以提供更全面的质量保障。在批次检测中，推荐加入阴性和阳性参考品进行质量控制，完成整个高通量测序流程。阴性参考品包括水、PBS等不含Ig/TCR重排样本，阳性参考品包含Ig/TCR的细胞或DNA。
推荐意见3-1：推荐选用IgH、Igκ、Igλ（B-ALL）及TRB、TRG、TRD（T-ALL）为目标基因。
推荐说明：BCR与TCR由多条链组成。BCR重链为IgH（以及不完全重排IGH），轻链包括Igκ（IGK）、IgκDE（IGKDE）和Igλ（IGL）。T细胞分为αβ型和γδ型：αβT细胞的重链为TRB（或不完全重排TRB），轻链为TRA；γδT细胞的TCR重链为TRD（或不完全重排TRD），轻链为TRG。这些链的基因序列可以作为检测对象。在临床检测中，推荐检测Ig基因包括IGH、IGK和IGL三条链， TCR基因包括TRB、TRG和TRD三条链。同时，还必须需要加入Housekeeping gene或internal reference genes 用于估算总有核细胞数。
推荐意见5：推荐基于大样本量数据库在NGS-MRD检测中建立明确序列的检测限参数（LoB、LoD和LoQ），分别用于本底评估、阴阳性判读及动态监测。
推荐说明：分析检测限参数主要包括空白限（Limit of Blank，LOB）、检出限（Limit of Detection，LOD）和定量限（Limit of Quantitation，LoQ）。LoB是95%健康样本中目标序列所能达到的最高水平。LoD是在≥95%的阳性样本中能够可靠检出目标序列的序列最低浓度，数值越低表明灵敏度越高。LoQ是在≤70%相对总误差范围内定量测定的目标序列最低水平。
建议构建包含数百至数千例健康人群标本的 Ig/TCR免疫组数据库3，借助数据库评估各序列独特性和 LOB、LOD、LOQ2，有效区分肿瘤特异性克隆信号与生理性背景克隆，为单条序列 MRD 阳性判定提供依据19。现阶段TCR 序列 LOB和LOD 的应用研究相对有限，仍需依托更大规模健康人样本数据库、开展序列特异性研究进一步完善3,19。LOD和LOQ需结合DNA上样量、序列的独特性以及测序深度等因素综合评定。
推荐意见6：NGS MRD报告应包含患者与样本基本信息、克隆鉴定信息（CDR3序列、V(D)J基因名称、频率、LOD/LOQ）、随访追踪MRD值及定性结论。
推荐说明：报告应至少包含以下信息：（1）常规信息：患者基础信息（姓名/编号、性别、年龄）、样本基础信息（疾病类型、样本来源、采集日期）、检测日期与报告日期。（2）癌细胞克隆鉴定报告：显著性克隆的核心信息，包括克隆链、CDR3基因序列、V（D）J基因名称、各克隆的频率及占有核细胞比例、样本DNA投入量或换算后的投入细胞量、检测限（LOD）、定量限（LOQ）。（3）随访样本MRD追踪检测报告：展示克隆序列追踪的可视化结果，包括各时间点初诊的各条显著性克隆序列的MRD值、最终MRD值、MRD定性结论（残留阳性/未检出）。序列信息至少包含CDR3区域核酸组成、V、(D)、J、C基因名称等有效识别信息。
推荐意见7：鉴于Ig/TCR显著性克隆判定尚无统一标准，建议实验室选用ClonoSEQ（≥3%丰度、≥0.2%有核细胞、不连续分布、≥40基因组当量）或EuroClonality（≥5%及链特异性比值）等已验证规则。
推荐说明：目前全球尚无统一标准，仅clonoseq®获FDA批准应用于B系白血病和多发性骨髓瘤的检测。对于BCR，不同平台如clonoseq®、EuroClonality、LymphoTrack等均有公开鉴定优势克隆标准，优势克隆丰度≥3%、5%或2.5%等不同阈值设置。而对于T系，由于更难区分反应增生克隆和恶性克隆，目前FDA未获批TCR NGS MRD检测产品。
（1）ClonoSEQ检测鉴定 “显著性克隆”序列的标准（需全部满足）：①序列占该总序列总量≥3% (BCR）或5%(TCR)；②占样本中总有核细胞数≥0.2%；每个样本的总有核细胞数量通过反应过程中扩增一组内参基因来确定，以确认已分析足够的样本量；③分布呈不连续性（按频率排序时相邻十分位区间内不超过5个序列）；④该序列≥40个估算基因组当量。
（2）EuroClonality/BIOMED-2 clonality assays明确BCR显著性克隆判定标准，首先要求优势克隆丰度 ≥ 5%；同时需满足克隆/背景克隆比值>阈值，每条链设置的阈值不同：IGH-VDJ、IGH-DJ、IGK、IGKDE分布在3.2-7.4之间；TCR判定显著性克隆标准沿用BCR。LymphoTrack采用分层设置优势克隆界，20000 reads以上用2.5%，10000-20000reads用5%。
（3）中国的大多检测机构自研检测体系，对于BCR/TCR主要延用参考FDA-cleared clonoseq®标准，如Seq-MRD®检测。
（4）治疗过程中产生的新发显著性克隆判断标准一般与初诊显著性克隆判断条件一致。
推荐意见8：推荐以肿瘤细胞占总有核细胞数比例计算MRD值，多克隆时建议分开报告各序列值、LOD/LOQ值及趋势图。
推荐说明：MRD采用肿瘤细胞数占总有核细胞数的比例指标，而非肿瘤细胞占总B或T细胞的频率。推荐报告中分开报出各条显著性序列的MRD数据或图示追踪。但关于总MRD值的报告，目前主要有取总和或者去最高值两种方式。例如首诊鉴定出3条IGH序列、2条IGK序列，随访时需计算出每条序列的MRD值。对于总MRD，总和法是将3条IGH序列的MRD值和2条IGK的MRD值分别相加，然后去最高值的受体链作为最终的MRD值（IGH高取IGH，IGK高取IGK）。而最高值法则是取所有序列中频率最高的序列的MRD水平作为最终的MRD值。推荐对于不同链的不同预后意义进行标注。推荐结合序列特异性和样本不同输入量等条件在报告中展示各条序列的LOB、LOD、LOQ，而非仅提供方法学检测能力固定阈值如灵敏度10-6。
推荐意见9：实验室开展NGS-MRD检测前，应系统验证灵敏度、特异性、精密度与重复性、线性、准确性和整体流程稳定性，确保方法学可靠。
推荐说明：实验室开展NGS-MRD检测前，应参考ClonoSeq或EuroClonality-NGS等已验证体系，预先完成方法学验证，建议至少验证下列内容：（1）线性、灵敏度的特异性（LOB、LOD、LOQ）：用梯度稀释模拟目标序列的不同含量，在不同DNA投入量下开展线性验证，同步计算灵敏度和特异性；（2）精密度与重复性：分析跨批次、关键仪器、操作者等检测重现性；（3）准确性：分析NGS结果与流式细胞术结果的一致性；（4）数据完整性和可追溯性：建立完善的数据全链条保存机制。
推荐意见10-1：显著性序列的特异性与其类别有关，B-ALL中IGH的特异性高于IGK、IGKDE和IGL。
推荐说明：在儿童B‑ALL中，85%以上的患儿初始诊断时都可检测到IGH基因重排，而检出IGK和IGL 基因重排的比例相对较低。Chen等的研究显示，IGH-MRD具有明确的预后分层价值，EOC时IGH MRD<0.0001%、0.0001%~<0.01% 和≥0.01%的患儿的3 年EFS 分别为95.3%、86.1%和74.0%（P<0.001）。而治疗后IGK、IGKDE和IGL基因重排阳性的预后意义不明确，考虑可能存在白血病非特异性克隆导致的假阳性。Chen等的研究还显示，持续完全缓解的儿童 B-ALL 患者中仍可长期检出部分IGK/IGKDE克隆，且多数也存在于健康人群中。在针对成人ALL异基因HSCT人群的NGS/MRD研究中也发现，B-ALL患者移植后仅检出IGH MRD克隆型者复发比例较高，而仅检出非IgH（IGK/IGL）MRD克隆型者多数未复发。
推荐意见11：对于初诊时无法检出符合标准的显著性序列的患儿，不推荐采用NGS方法进行MRD的追踪监测。
推荐说明：NGS-MRD 监测的核心原理是追踪初诊时鉴定出的白血病细胞特异性克隆序列（Ig/TCR 基因重排）。若初诊样本中未能检出符合频率阈值的优势克隆，后续随访将失去比对靶标。此时应及时选择多色流式细胞术（MFC）或融合基因定量 PCR 等其他方法进行 MRD 监测，以避免假阴性并确保监测的连续性。
研究表明，约 90%的 B-ALL 和85%的T-ALL患儿可以在初诊时成功鉴定出至少一种可用于 MRD 追踪的 Ig/TCR 克隆序列。对于没有鉴定到Ig显著性克隆的 B-ALL 患者，可选择对 TCR 基因重排进行测序，这可能会在某些患者中识别出可追踪的序列。无法检出符合标准的显著性序列常见原因包括：肿瘤负荷过低，癌细胞克隆频率低；CDR3区以外发生突变且位于PCR引物结合区域，导致引物无法结合上去从而扩增不到癌细胞信息；肿瘤为多克隆起源，各克隆频率被均摊，与正常免疫克隆无显著频率差异；在Ig/TCR重排前已经发生了癌细胞的转变（如ETP-ALL），样本中的B或T淋巴母细胞过于不成熟，以致在V(D)J重组前停滞于成熟过程，导致缺乏独特的CDR3序列，导致克隆鉴定失败。
推荐意见12：治疗过程中出现的新发显著性克隆，多为正常前体B细胞反弹和部分免疫细胞快速扩增，推荐结合序列特异性及其频率、MRD水平和临床表现综合研判，多数情况下动态观察为主。
推荐说明：对于治疗过程中出现的新发显著性克隆，大部分系治疗本身诱导正常的前体B细胞反弹（hematogone）和部分免疫细胞快速扩增，表现为新发克隆序列的短期增加。通常新发克隆的清除慢于白血病克隆，可以长期存在或3个月内快速消失，或退化到背景克隆中。研究发现大部分患者复发克隆与原发克隆相同，仅很少比例可能存在克隆演化或原来的卫星克隆转变为主克隆复发。发现新克隆时，应进行回溯性追踪。若该序列在诊断时不存在且丰度急剧升高，需结合流式表型和临床症状（如发热、血细胞减少）排除继发淋巴增殖性疾病。
若新发克隆为低水平、短期波动，且与原发白血病克隆、流式MRD、形态学及临床表现不一致，通常更倾向于反应性或非特异性背景克隆，建议动态观察。当新发显著性克隆序列特异性高且持续处于高频时需要警惕肿瘤克隆的可能，还需关注新发克隆与原发高特异性克隆表现是否一致，若出现高频新发克隆且伴随原发克隆回升，则可能提示复发风险。
推荐意见13：对于B-ALL，优先选择IGH等高多样性序列作为MRD追踪靶标；对IGK/IGL等低多样性轻链序列需谨慎解读低水平信号，排除“公共序列”背景干扰，避免假阳性判读。
推荐说明：在BCR的各序列中， IGH基因重排相较于IGK和IGL基因重排，能提供更强的预后特异性。IGH发生V-D-J重排，组合多样性高，而IGK和IGL发生的V-J重排，且N区（连接V区和J区的核苷酸序列）插入较少。这种较低的多样性导致不同的个体（包括健康人和白血病患者）很容易产生完全相同的轻链序列，这些序列被称为“公共序列”。研究发现，处于持续完全缓解（CCR）2年以上的B-ALL患儿中，仍有 12.4% 的IGK显著性序列在化疗12个月后仍可被检测到。经过与健康人数据库比对，这些持续存在的克隆中，高达 88.5% 在健康个体中出现的概率大于10%。这意味着这些检测到的“残留信号”并非来自白血病细胞，而是来自患者自身正常的B细胞重建或背景噪音。
推荐意见14：部分B-ALL和健康人群的IGK序列V-J链接的N区的核苷酸长度有所区别，推荐采用N区长度> 4个核苷酸的规则来过滤掉部分公共序列。
推荐说明：分析V-J链接的N区的核苷酸长度有利于区分白血病克隆和来自健康人群的非特异性克隆。非特异性克隆N区长度通常 ≤ 4个核苷酸，而白血病克隆N区长度不固定，可以> 4个核苷酸。ROC曲线分析表明，N端长度预测特定克隆重排型的准确性高（AUC=0.908），当N端长度超过3.5个核苷酸时，敏感性和特异性分别为91.7%和81.5%。因此，建议在诊断建库阶段增加“N区长度”筛选步骤。过滤掉N区过短（<4nt）的序列可有效避免治疗后期因正常B细胞重建或公共序列干扰导致的“假阳性”，从而更准确地评估复发风险。
推荐意见15：基于TCR的NGS MRD监测能覆盖85%左右的儿童T-ALL病例，但ETP的覆盖率较低。推荐同时检测TRB、TRG和TRD进行MRD的追踪。
推荐说明：2012年研究者首次将HTS应用于T-ALL/LBL的诊断和MRD检测，一般认为TRB由于基因重排多样性高于TRD/TRG，其特异性较高，预后价值高于TRG/TRD。Liao等人关于NGS-MRD研究发现在non-ETP-ALL患者中，89.7%的病例携带适合通过NGS进行MRD监测的优势序列，而ETP-ALL仅为50.0%，既往研究结果类似。超过90%的T-ALL患者携带TRB重排，超过80%携带TRG重排，而TRD重排比例在成人中接近70%，儿童中40%-50%。TRB克隆型序列多样性高，背景干扰较小；高变区特异性强，辨识度高，不易出现假阳性，灵敏度高，稳定性好；而TRG和TRD的胚系编码库有限性，导致正常T细胞中的重排片段比较相似，易产生较高的扩增背景，TRD在部分T细胞恶性肿瘤中存在表达缺失。因此TRB作为MRD标志物可靠性更高。
最近，clonoSEQ T细胞检测进行了更新，纳入了TRB和TRG重排分析。浙大儿院117例T-ALL儿童NGS-MRD研究结果表明，TRB和TRG/TRD在治疗后变化一致性较高，均有预后意义；巩固治疗后TRB和TRG/TRD如果同时阳性者预后极差，4年EFS仅35.0%。对于TRB和TRG不可追踪的患者，TRD的检测仍有价值。T-ALL患者在复发时，分别有97%和86%的TCR重排得以保留，其中TRD重排稳定性最高（复发时100%保留），其次是TRG（89%）和TRB重排（82%）。因此，整合TRB、TRG和TRD进行TCR MRD追踪是具有临床价值的。
推荐意见16：推荐为每条肿瘤克隆序列单独建立LoD、LoQ，结合序列特异性、动态变化及多序列一致性综合判读MRD；低特异性序列需谨慎区分背景与残留，避免孤立数值误判。
推荐说明：NGS检测Ig/TCR基因重排具有高度的序列多样性，但不同重排序列在正常人群或化疗后免疫重建过程中的背景水平差异巨大。序列的“独特性”直接影响其LoD/LoQ：通常LoD/LoQ越低，序列越独特，越倾向于代表临床相关的MRD。不能采用统一的固定阈值，必须为每条克隆序列单独建立LoD和LoQ。例如，在clonoSEQ等NGS-MRD体系中，IGH序列平均较IGK/IGL更具独特性、预后价值更高，但个体层面仍可能出现相对不独特的IGH或相对独特的轻链序列，因此应以各序列自身的LoD/LoQ作为判断依据，并在多序列可追踪时优先重视最低LoD/LoQ序列的结果。当仅剩单一序列可追踪且处于低水平时，难以仅凭一次结果可靠区分真阳性与背景噪声，此时密切的序贯监测尤为重要：真正的MRD更可能呈现上升或下降的趋势性变化，而背景序列往往相对稳定。此外，即使某些序列本身特异性不高，但如果其与更特异（低LoD）序列同步出现或呈一致的动态变化，则不应简单将其视为背景，而应纳入整体评估框架。在不确定情况下，建议进行重复检测以观察克隆型动态，并结合临床情境综合权衡风险获益；必要时可寻求实验室或领域专家协助解读，以减少因误判低水平信号而导致的不必要干预。
NGS-MRD通常追踪初诊时鉴定的多条IG/TR序列，这些序列源自同一白血病克隆，理论上应同步消长。但临床中常出现部分序列阳性而其他阴性，或丰度变化趋势不一致的情况。解读结果时须评估各序列是否一致变化，若仅单一、独特性较低的序列出现而不与其他序列同步，则更可能代表背景信号而非肿瘤残留。忽视一致性可能误判为MRD阳性，导致不必要的干预。
推荐意见17-1：推荐在B-ALL诱导结束（EOI）以10⁻⁴、巩固结束（EOC）以10⁻⁶作为NGS MRD的分层阈值。
推荐说明：NGS-MRD通常需先在诊断基线样本中识别白血病相关IG/TR克隆重排，建立患者特异性的克隆指纹，再在治疗后关键时间点追踪相同克隆序列的清除情况。Chen等人的研究显示，EOI时NGS-MRD<10⁻⁶、10⁻⁶至<10⁻⁴、≥10⁻⁴三组的3年EFS分别为97.3%、96.0%和83.3%（P=0.002），提示EOI阶段10⁻⁴较10⁻⁶更适合作为风险分层阈值。而在EOC时，NGS-MRD<10⁻⁶、10⁻⁶至<10⁻⁴、≥10⁻⁴三组的3年EFS分别为96.4%、75.4%和83.4%（P=0.002），提示EOC阶段低于10⁻⁶是区分高危和低危患儿的重要阈值。另一项基于COG队列的研究分析了儿童B-ALL诱导结束时NGS-MRD的不同分层阈值。研究显示，预后不良事件主要集中于EOI MRD≥10⁻⁴的患者；当阈值进一步降低至10⁻⁵或10⁻⁶时，会导致阳性组与阴性组的5年EFS区分度下降。Cox风险比分析显示，EOI的最佳风险分界均为10⁻⁴ 。
对于T-ALL，Liao等人的研究显示EOI的NGS MRD并无预后价值，但EOC的NGS MRD水平与预后密切相关。EOC时NGS-MRD<10⁻⁶、10⁻⁶至<10⁻⁴、≥10⁻⁴三组的4年EFS分别为81.6%、61.9%和45.1%。该时点的NGS MRD转阴预示骨髓复发率低（4.2%），但并不能预测髓外复发。
推荐意见17-2：推荐在T-ALL中，EOC时以10⁻⁶作为NGS MRD的分层阈值。
推荐意见18：推荐骨髓作为B-ALL NGS-MRD监测的首选标本；外周血可作为无创替代用于频繁监测及移植/CAR-T后随访，但可能漏检极低水平MRD。
推荐说明：骨髓是MRD监测的标准样本来源，通常肿瘤负荷比外周血高1-2个对数级，敏感性更佳，容易早期发现极低水平的MRD。外周血的优势是无创、适合频繁监测，但敏感度可能略低于骨髓，极早期复发可能骨髓阳性而外周血阴性。
有多项研究比较了利用外周血和骨髓样本进行NGS MRD监测的一致性。在一项包含69例成人ALL患者的前瞻性研究中，外周血与骨髓MRD之间存在强相关性（r = 0.87；P < .001）。以骨髓MRD为参照，外周血MRD检测的灵敏度和特异度分别为87%和90%。在HCT后复发以及CAR-T后复发的患者中，分别有100%和85%的患者其外周血MRD转为阳性；从MRD阳性到临床复发的中位时间分别为90天和60天。在一项针对808例标危B-ALL儿童的大型研究中，对配对的EOI时的BM和PB样本进行了NGS MRD检测，外周血和骨髓的NGS MRD呈强相关，相关系数为0.75。骨髓MRD呈阳性的患者中，84.1%的患儿外周血MRD也呈阳性。这些研究表明，外周血NGS MRD可能是骨髓MRD监测的合理替代方案。然而需要注意的是，由于外周血中的整体疾病负荷较低，外周血监测可能无法检出极低水平的MRD。
推荐意见19：无论B-ALL还是T-ALL，NGS MRD的敏感性和预后价值均高于MFC MRD。推荐有条件的中心在EOI和EOC时开展NGS MRD监测。
推荐说明：MFC（多参数流式）常规灵敏度为10-4。虽然速度快，但在低肿瘤负荷时容易漏诊。NGS-MRD灵敏度极高（达到10-6），仅受限于输入DNA量，在检测极低水平残留时优于流式。目前已有多项研究显示对于治疗后MFC阴性的患儿，无论是B-ALL，还是T-ALL，NGS MRD阳性患儿的预后仍明显差于NGS MRD阴性的患儿。如Chen等在纳入430例儿童B-ALL的研究结果显示EOI MFC-MRD阴性患者中有26.3%被检测到NGS-MRD阳性（≥10-4），3年EFS明显低于NGS-MRD阴性患者（84.7% vs. 97.0%，P=0.008）。来自COG AALL0331和AALL0232研究的619份配对儿童B-ALL治疗前和EOI骨髓样本分析发现，MFC MRD< 0.01%的患儿中，仍有55名患儿NGS MRD≥0.01%（占MRD阳性患者38.7%，占研究总人群9%），其预后明显差于NGS MRD< 0.01%的患儿（P=0.036, 95% CI 1.016-2.224）。
T-ALL中，Wu等人基于TRB和TRG的NGS MRD检出了MFC未能发现的MRD（≥0.01%：25/35 vs. 13/35）。Liao等人的研究显示，117例T-ALL患儿在EOI MFC-MRD实现转阴的患者中，42.9% NGS MRD<10-4，仅有26.0%的患者NGS-MRD<10-6。EOC时，37.4%的MFC阴性患者仍呈NGS-MRD阳性，且该组（NGS+/MFC-）患者的预后显著差于双阴性患者（4年EFS 60.8% vs. 84.9%, P = 0.038）。这种差异主要源于NGS更高的灵敏度，尤其是在低水平MRD检测中，几乎所有不一致的结果均为NGS阳性而MFC阴性（NGS+/MFC-），且这些患者往往预示着快速复发，为临床提供了宝贵的干预窗口期。
推荐意见20：对于针对Ig/TCR基因重排的MRD监测，推荐将NGS方法作为qPCR的补充或替代方案，尤其对qPCR检测出的不可量化阳性结果，建议利用NGS复核以鉴别真伪阳性。
推荐说明： NGS-MRD通过直接识别诊断时V(D)J/CDR3克隆序列，可同时分析多个Ig/TCR重排，具有较宽的定量范围和较高的序列特异性。在一项纳入76例儿童ALL、210份样本的研究中，NGS与qPCR MRD结果总体相关性良好（R²=0.72），且第33天NGS-MRD对复发的预测优于qPCR：NGS阴性与阳性患者5年RFS为90%和53%（P=0.0003），而qPCR对应为84%和63%（P=0.04），提示NGS-MRD在诱导结束时可能具有更优的复发风险判别能力。Svaton等在432例儿童BCP-ALL中对诱导结束780个IG/TR MRD标志物进行qPCR与NGS平行检测，发现两者结果在639个标志物（81.9%）中一致，MRD定量水平相关性良好（R=0.83）；且NGS使19%的患儿排除qPCR假阳性，并使得5%的患儿因检出真实低水平MRD而上调风险分层。对于qPCR不可量化阳性（PnQ/PBQR）结果，104个仅qPCR阳性的标志物中97个（93.3%）为PnQ；部分标志物虽可被NGS检出，但因相同IG/TR重排见于无关样本而被判定为非特异性。该研究还发现非特异性标志物的V(D)J连接区N区较短，提示此类低水平阳性结果需结合序列特征进一步确认。因此，对于qPCR-PnQ或低水平边界阳性结果，尤其是在结果将影响风险分层或治疗干预时，建议采用NGS进行复核，以提高MRD判读特异性。
推荐意见21：在Ph+ALL中，针对BCR::ABL1阳性的CML样亚型，推荐采用基于Ig/TCR的NGS MRD监测以提高准确性。
推荐说明：在Ph+ ALL中，BCR::ABL1融合基因与Ig/TCR-MRD在低负荷时的差异可反映“CML-like”生物学特征。Short等采用灵敏度达10⁻⁶的Ig/TCR NGS-MRD检测评估Ph+ ALL，发现约15%–30%达到NGS-MRD阴性的患者仍可检出BCR::ABL1转录本。合并分析显示，PCR阳性/NGS阴性与PCR阴性/NGS阴性患者的5年无复发生存率和总生存率相近；部分长期低水平BCR::ABL1持续阳性但NGS-MRD阴性的患者在随访中未发生复发。因此对于Ph+ ALL不建议仅依据BCR::ABL1转录本水平调整治疗策略，推荐联合Ig/TCR检测以提高准确性；在具备条件时，可优先采用高灵敏度Ig/TCR NGS-MRD用于风险分层和临床决策。
推荐意见22：推荐B-ALL患儿在HSCT前后进行NGS MRD监测：移植前MRD状态用于分层复发风险；移植后MRD阳性可早期预警复发，指导抢先干预。
推荐说明：HSCT前后MRD状态是ALL移植后复发风险评估和干预决策的重要依据。 COG ASCT0431研究显示，移植前NGS-MRD阴性与阳性患者2年复发率分别为0%和53%，2年OS分别为96%和48%。移植后+30天NGS-MRD阳性患者复发率达67%，任意移植后NGS-MRD阳性均显著增加复发风险。成人ALL移植队列亦显示，移植前低水平MRD（<10-4）仍增加复发风险，移植后任意水平NGS-MRD阳性也是强复发预测因素。移植后NGS-MRD监测可在形态学复发前识别分子学复发，为抢先干预提供时间窗口，但个体差异较大。Logan等在成人ALL移植队列中发现，移植后外周血Ig/TCR NGS-MRD≥10-6对复发的阳性预测值为100%，复发风险显著升高 (HR 14; 95% CI, 4.7 to 44, P < 0.0001).，从首次检出至临床复发的中位提前时间为89 d（PMID: 24769317）。一项成人ALL前瞻性研究进一步显示，所有移植后复发患者在临床复发前均可于外周血检出NGS-MRD，首次阳性至复发的中位时间为90 d（PMID: 34424318）。Seferna等在儿童及年轻成人研究中发现，HSCT后NGS阳性组与阴性组的1年RFS分别为40%和96%，3年OS分别为33.3%和94.4%，差异显著。因此，HSCT前后NGS-MRD阳性结果可作为危险分层及个体化干预评估的依据。
但需要注意的是，移植后早期（尤其是前1-2年），受者体内会发生剧烈的免疫重建。在此过程中，供者的T细胞和B细胞克隆会扩增，可能导致NGS-MRD检测出“新发克隆”或“低水平阳性”，这不一定是复发。若检测到的是诊断时原有的克隆（原发克隆）再次出现，且呈上升趋势，则考虑复发。一项儿童/青少年ALL研究指出移植后免疫重建可导致低水平非特异性扩增，对移植后低阳性qPCR结果用EuroClonality-NGS复核，仅27.7%被确认真阳性。
推荐意见23：推荐B-ALL CAR-T治疗后28天行骨髓NGS MRD评估：清零者预后良好，可测及者（含<10⁻⁶）复发风险高，可为桥接移植等早期干预提供关键依据。
推荐说明：ELIANA和ENSIGN研究的儿童/青少年 R/R B-ALL联合分析中，CAR-T治疗后D28骨髓NGS-MRD清零者2年EFS和OS分别为68%和84%，而任意水平可测及者分别为23%和47%；多因素分析显示，D28骨髓NGS-MRD可测及独立增加复发风险（HR 4.87），3个月时风险进一步升高（HR 12）。这为后续造血干细胞移植的决策提供了依据。
在接受靶向CD19 CAR-T细胞治疗后，患者的B细胞表面抗原（CD19）可能丢失或下调（即抗原逃逸），导致基于抗体的MFC无法检测到复发。NGS检测的是DNA重排（Ig/TCR），不受细胞表面抗原表达变化的影响，具有独特价值。另外， 在CAR-T治疗后，若患者外周血或骨髓中出现持续的B细胞发育不全（B-cell Aplasia, BCA），但NGS-MRD转为阳性，此时应高度怀疑CD19阴性（CD19-）复发。NGS-MRD的升高往往早于形态学复发，是指导临床进行早期干预（如桥接移植）的关键依据。
推荐意见24：推荐B-ALL免疫治疗前后开展NGS-MRD监测，指导HSCT及后续治疗决策。
推荐说明：NGS-MRD可评估免疫治疗后的深度分子缓解，并帮助识别需进一步MRD导向治疗或桥接HSCT的高危患者。一项儿童B-ALL研究显示，68%的MFC-MRD阴性但NGS-MRD阳性患儿在接受1个疗程blinatumomab后，可达到NGS-MRD转阴。成人B-ALL研究亦发现66%MRD阳性患者接受blinatumomab后可达到NGS-MRD阴性；NGS-MRD阴性和持续阳性者2年OS分别为91%和48%，未达NGS-MRD阴性且未行HSCT者2年RFS/OS均为27%，而后续HSCT者均为71%。因此建议免疫治疗前后采用基于诊断期Ig/TCR克隆的NGS-MRD进行深度疗效评估和序贯监测，可作为后续HSCT、CAR-T或其他MRD导向治疗决策的重要依据。
免疫治疗可清除传统MFC/qPCR可测及MRD，但治疗后仍可能存在更低水平残留病灶及抗原逃逸风险。CD19靶向治疗（blinatumomab、CAR-T）后可发生CD19阴性复发、免疫表型改变及谱系转换，可能影响MFC判读，而NGS-MRD通过追踪Ig/TCR克隆，不依赖CD19/CD22等表面抗原表达，有助于减少抗原表达改变导致的漏检。
除上述推荐意见外，您认为关于儿童ALL的NGS MRD监测，还有哪些重要问题需要在本共识中进行阐述?
